1. 預制酶標板包被上分析物特異性抗體(包被抗體)，未結合的包被抗體被洗脫。后完成封閉操作，得到預包被酶標板。

2. 加入的樣本或標準品將被固定的包被抗體所捕獲，未被捕獲的成分將被移除。

3. 加入的生物素化檢測抗體將結合已被包被抗體捕獲的分析物，未結合的成分將被洗脫。

4. 加入HRP酶結合物結合生物素化檢測抗體，未結合的成分將被洗脫。

5. 加入TMB底物溶液，藍色與樣品中存在的分析物的量成比例。加入終止液后，底物顯色變化終止，孔內顏色由藍色變成黃色。測量450nm處各孔的吸光度值。