儲存條件

本試劑盒在室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存12個月；更長時間的保存可置于2-8℃。（注意：當低溫貯存時，使用前應先將試劑盒內的溶液在室溫中放置一段時間，必要時可在37℃水浴中預熱10 min，以平衡溶液溫度）。單獨包裝的RNase A在室溫可穩定保存12個月以上。加入RNase A后的溶液P1應置于2-8℃保存，可穩定保存6個月。

產品簡介

本試劑盒采用獨特的硅膠膜吸附技術，高效專一地結合質粒DNA。同時采用特殊的去內毒素溶液ER和過濾柱CS1，可有效的去除內毒素、蛋白等雜質；整個提取過程僅需1個小時，方便快捷。以下操作步驟適用于提取5-15 ml過夜培養的大腸桿菌,質粒提取得率和質量與宿主菌的種類和培養條件，細胞的裂解，質?？截悢担|粒的穩定性，抗生素等因素有關。

使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于轉染多種細胞及各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接等實驗。

注意事項 請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。

1.溶液 P1 在使用前先加入 RNase A（將試劑盒中提供的 RNase A 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。

2.使用前先檢查溶液 P2 和 P3 是否出現渾濁，如有混濁現象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清。

3.所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心，速度為 12,000 rpm (~13,400×g )。

4.去內毒素溶液 ER 在多次開蓋使用后，可能會有細微的顏色變化，不影響最終質粒提取效率和純度。

5.提取的質粒量與細菌培養濃度、質?？截悢档纫蛩赜嘘P。如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?10 kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加 P1、P2、P3 的用量，洗脫緩沖液應在 65-70℃預熱?？梢赃m當的延長吸附和洗脫的時間，以增加提取效率。

操作步驟

使用前請先在漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其它用途

1.取5-15 ml過夜培養的菌液加入離心管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，盡量吸除上清。

注意：菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中, 菌體量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會降低質粒的提取效率。

2.向留有菌體沉淀的離心管中加入500 μl溶液P1 （請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器吸吐或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。

注意：請務必徹底懸浮細菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3.向離心管中加入500 μl溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。

注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA。此時菌液應變得清亮粘稠，所用時間不應超過5 min，以免質粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。

4.向離心管中加入500 μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀，然后室溫放置10 min左右，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心10 min，此時在離心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5.將上一步收集的上清液分次加入過濾柱CS1（過濾柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g ) 離心2min，小心地將過濾離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP2中（吸附柱放入收集管中），（如果過濾柱中有殘余的液體，說明步驟4的上清中雜質過多，可以延長離心的時間；如果離心后收集管底部有少量的沉淀，盡量地吸取上清）。

6.12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP2放入收集管中。

7.向吸附柱CP2加入750 ml 去內毒素溶液ER（已經加入異丙醇），靜置2分鐘使管柱膜平衡，室溫12,000rpm (~13,400×g)離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8.向吸附柱CP2中加入700 μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g ) 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP2放入收集管中。

注意：加入漂洗液PW后，如果室溫靜置2-5 min，有助于更好地去除雜質。

9.重復操作步驟8.

10.將吸附柱CP2重新放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂

洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP2開蓋，置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

11.將吸附柱CP2置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300 μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心1 min將質粒溶液收集到離心管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應少于100μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響，若后續做測序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。且DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質粒的回收率，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g) 離心2 min，將質粒溶液收集到離心管中。