選配的試劑

蛋白酶K（20mg/ml）目錄號：GF0202-01，客戶自備，提取動物組織總RNA時需配備  溶菌酶（50mg/ml）目錄號：GF0203-01，客戶自備，提取細菌總RNA 時需配備

儲存條件

DNase I溶液（DNase I 凍干粉溶解于專用保存液），儲存于-20℃，可反復凍融； 其他試劑室溫（15-25℃）保存。

產品簡介

總RNA提取試劑盒提供了快速簡單且有效的方法，可從各種動物組織、培養細胞及細菌、植物組織、   中提取總RNA。本試劑盒采用離心管柱的方式，配合使用我司獨特的硫氰酸胍裂解液，使組織或細胞裂解   及均質化，并加入乙醇使RNA選擇性的與管柱膜結合，于操作過程中加入DNase Ⅰ以去除殘留的基因組DNA，經過多次“洗滌及離心”的步驟去除污染雜質，再以無核酸酶水回收結合在管柱膜上的RNA。若RNA     小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,無法在此系統中被有效地回收。提取的總RNA純度高，基本沒有DNA    和蛋白質污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

本試劑盒同樣適用酵母，可以從酵母菌中提取總RNA,具體操作方法見“附錄Ⅰ”。

本試劑盒也可用于將以其他方法提取的 RAN 進行clean up 或去除基因組DNA 污染，詳見“附錄Ⅱ”。

預防RNase污染，應注意以下幾方面

1. 經常更換新手套，因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。

2. 使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3. RNA在裂解液RL中時不會被RNase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液應使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%(V/V)，高壓滅菌）。

   使用前注意事項

1. 使用前請向裂解液RL 添加 350ul 巰基乙醇，添加過巰基乙醇的裂解液 4℃保存。

2. 使用前請向漂洗液PW 添加 64ml 無水乙醇。

3. 為確保RNA 的品質及產量，應盡量收取新鮮的動物組織進行 RNA 提取，或將組織立即以液氮冷凍，儲存于-70℃，組織亦可保存在RANstore 樣本保存液（目錄號：TR38）中。樣本保存在 RNAstore 試劑中，可于37℃存放 1 天、4℃存放 1 個月、-20℃永久保存，所提取的 RNA 品質與儲存在液氮中相同。

操作步驟

一、從培養細胞中提取總 RNA

1. 收集細胞

a. 懸浮細胞的收集（收集細胞數量請不要超過 1×107）：估計細胞數量，300×g 離心 5 min，將細胞收集到離心管中，仔細吸除所有培養基上清。

b. 單層貼壁細胞的收集（收集細胞數量請不要超過 1×107）：可直接在培養容器中裂解（容器直徑不超過 10 cm），或者使用胰蛋白酶處理后離心收集細胞沉淀。（在搖瓶中培養的單層貼壁細胞通常采用胰蛋白酶處理的方法。）

? 直接裂解法：確定細胞數量，徹底吸除細胞培養基上清，立即進行第 2 步裂解步驟。

? 胰蛋白酶處理法：確定細胞數量，吸除培養基，用 PBS 洗滌細胞，吸除 PBS，向細胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的 PBS 處理細胞，當細胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養基失活胰蛋白酶，將細胞溶液轉移至RNase-Free 的離心管中，300×g 離心 5 min，收集細胞沉淀，仔細吸除所有上清。

注意：收集細胞時一定要將細胞培養液去除干凈，否則會導致裂解不完全，影響 RNA 與吸附柱的結合， 造成RNA 的產量降低;請勿使用過多的樣本量，避免管柱杜塞而造成 RNA 的產量降低。

3. 將所有溶液轉移至過濾柱 CS1 上(過濾柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。 

4. 向濾液加入等體積 70%乙醇至裂解液中，混勻（此時可能會出現沉淀），轉至后面“RNA 提取步驟”。 

二、從動物組織中提取總 RNA

1. 勻漿處理：

每 10-20 mg 組織加 300 μl 裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入 β-巰基乙醇），用研磨杵將組織徹底研磨（如組織較難徹底研磨，可選用電動或玻璃勻漿器）；隨后向勻漿液 中加入 590 μl RNase-Free ddH2O 和

10 μl Proteinase K（20mg/ml），混勻后 56℃處理 10-20 min。

注意：組織量一定不要超過 20 mg，否則將導致RNA 得率和質量下降。

2. 將裂解混合液轉移至過濾柱 CS1(過濾柱 CS1 放入收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。 

3. 向濾液加入 0.5 倍上清體積的無水乙醇，均勻（此時可能會出現沉淀），轉至后面“RNA 提取步驟”。 

三、從細菌中提取總RNA

1.4℃12,000  rpm(~13,400×g)離心 2  min 收集菌體（收集菌體的最大量不超過 1×109），仔細去除所有培養基上清，以后的所有離心步驟均在室溫（20-25℃）進行。

注意：如果培養基上清去除不完全，將對第二步中的細胞壁消化過程產生抑制。

2. 用含有溶菌酶的 100μl TE 緩沖液（客戶自己配制，配制方法見下表）徹底重懸菌體，孵育時間見下表。  

3. 加入 350μl 裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），渦旋振蕩混勻。 

4. 將裂解混合液轉移至過濾柱 CS1 上(過濾柱CS1 放入收集管)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。 

5. 向濾液中加入 250μl 無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀），轉至后面“RNA 提取步驟”。 

四、從植物組織中提取總 RNA

本試劑盒不適用于富含淀粉、酚類和次級代謝物的植物組織（例如一些木本植物，胚乳或絲狀真菌的菌  絲體），因為 2-ME/裂解液在加入至樣本粉末后，會變固態或非常粘稠,此類植物組織請使用“多糖多酚植物總RNA 提取kit”（貨號 TR22）。 

1. 勻漿處理

50-100 mg 植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入 450 μl RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），渦旋劇烈震蕩混勻，并于 56℃孵育 3 分鐘。 

注意 1：在 56℃孵育 1-3 min 將有助于植物組織裂解，但是對于某些富含淀粉的樣品，請不要加熱處理， 防止因淀粉引起的樣品膨脹現象。

注意 2：由于植物多樣性非常豐富，而且同種植物的不同生長發育階段和不同組織的 RNA 含量都不相同， 請根據具體實驗情況選擇合適的植物材料的用量。

2. 將所有溶液轉移至過濾柱 CS1 上(過濾柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2-5 min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free 的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。

注意：由于裂解液較粘稠，所以將溶液轉移至過濾柱時，可以剪去部分吸頭末端。

3. 緩慢加入 0.5 倍上清體積的無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀），轉至“RNA 提取步驟”。 

u RNA 提取步驟 

此為續接樣本制備“一、二、三、四、五”后的RNA 提取操作步驟。

1. 將前一步所得“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀），移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

注意：將溶液和沉淀轉移至吸附柱CR1 時，如果體積大于吸附柱容量，可以分次完成。

2. 向吸附柱CR1 中加入 500ul 溶液RW，12,000 rpm (~13,400×g )離心離心 1 min，丟棄濾液，將吸附柱CR1 放回收集管中。

3. DNase Ⅰ降解。