產品細節圖:

培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒

品牌：genefist | 貨號：GF430

所屬大類 : 試劑

所屬小類 : 常用生化試劑

品牌 : genefist

規格 : 50次

原價 : ￥1024.00

促銷價 : ￥1024.00

選配的試劑

溶菌酶（50mg/ml）目錄號：GF0203-01，客戶自備，提取細菌總 RNA 時需配備

儲存條件

DNase I（為DNase I 凍干粉溶解于專用保存液），儲存于-20℃；

其他試劑室溫（15-25℃）保存。

產品簡介

培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒，提供了快速簡單且有效的方法，可從培養細胞和細菌中提取總RNA。本試劑盒采用離心管柱的方式，配合使用我司獨特的硫氰酸胍裂解液，使細胞或細菌裂解及均質化，并加入乙醇使RNA選擇性的與管柱膜結合，于操作過程中加入DNase Ⅰ以去除殘留的基因組DNA，經過多次“洗滌及離心”的步驟去除污染雜質，再以無核酸酶水回收結合在管柱膜上的RNA。若RNA小于200nt,如5sRNA、tRNA和microRNA,無法在此系統中被有效地回收。提取的總RNA純度高，基本沒有DNA和蛋白質污染，可用于PCR、芯片分析、Blot、PolyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

預防RNase污染，應注意以下幾方面

1.經常更換新手套，因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。

2.使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3.RNA在裂解液RL中時不會被RNase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4.配制溶液應使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%(V/V)，高壓滅菌）。

使用前注意事項

1.裂解液 RL：使用前請添加 300ul 巰基乙醇，添加過巰基乙醇的裂解液 4℃保存。

2.漂洗液 PW：使用前請添加 64ml 無水乙醇。

3.為確保 RNA 的品質及產量，應盡量收取新鮮的動物組織進行 RNA 提取，或將組織立即以液氮冷凍，儲存于-70℃，組織亦可保存在 RANstore 樣本保存液（目錄號：TR38）中。樣本保存在 RNAstore 試劑中，可于37℃存放 1 天、4℃存放 1 個月、-20℃永久保存，所提取的 RNA 品質與儲存在液氮中相同。

操作步驟

一、從培養細胞中提取總 RNA

1.收集細胞

a.懸浮細胞的收集（收集細胞數量請不要超過 1×107）：估計細胞數量，300×g 離心 5 min，將細胞收集到離心管中，仔細吸除所有培養基上清。

b.單層貼壁細胞的收集（收集細胞數量請不要超過 1×107）：可直接在培養容器中裂解（容器直徑不超過10 cm），或者使用胰蛋白酶處理后離心收集細胞沉淀。（在搖瓶中培養的單層貼壁細胞通常采用胰蛋白酶處理的方法。）

直接裂解法：確定細胞數量，徹底吸除細胞培養基上清，立即進行第 2 步裂解步驟。

胰蛋白酶處理法：確定細胞數量，吸除培養基，用 PBS 洗滌細胞，吸除 PBS，向細胞中加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的 PBS 處理細胞，當細胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養基失活胰蛋白酶，將細胞溶液轉移至 RNase-Free 的離心管中，300×g 離心 5 min，收集細胞沉淀，仔細吸除所有上清。

注意：收集細胞時一定要將細胞培養液去除干凈，否則會導致裂解不完全，影響 RNA 與吸附柱的結合，

造成 RNA 的產量降低;請勿使用過多的樣本量，避免管柱杜塞而造成 RNA 的產量降低。

2.裂解處理

a.對于離心得到的細胞沉淀：輕彈離心管底部，使細胞沉淀松散，加入適量裂解液 RL（詳見下表，使用

3.將所有溶液轉移至過濾柱 CS1 上(過濾柱 CS1 放在收集管中)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。

4.向濾液加入等體積 70%乙醇至裂解液中，混勻（此時可能會出現沉淀）。

5.將“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀）移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

注意：將溶液和沉淀轉移至吸附柱 CR1 時，如果體積大于吸附柱容量，可以分次完成。

6.向吸附柱 CR1 加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )離心離心 1 min，丟棄濾液。

7.DNase Ⅰ降解。

每一純化反應，請將 80 ul DNase 消化液與 10ul DNaseⅠ預先混合在新的離心管(輕彈或翻轉離心管以混合均勻，請勿震蕩)，將 90 ul “DNaseⅠ工作液”加入至吸附柱的膜中心，于室溫（25~28℃）孵育15 分鐘。

注意：如同時操作多組樣本，請使用前現配新鮮的 DNaseⅠ工作液,請勿預先配制保存 DNaseⅠ工作液。

8.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

9.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g) 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

10.重復操作步驟 9。

11.12,000 rpm(~13,400×g)離心 3 min，將吸附柱 CR1 置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱 CR1 在室溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的 RT 等實驗。

12.將吸附柱 CR1 轉入一個新的 RNase-Free 離心管中，加入 30-100 μl 無酶雙蒸水至吸附柱的膜中心，室溫靜置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，得到 RNA 溶液。

注意：洗脫緩沖液體積不應少于 30 μl，體積過小影響回收效率；RNA 溶液請于-70℃保存。

二、從細菌中提取總 RNA

1.4℃12,000 rpm(~13,400×g)離心 2 min 收集菌體（收集菌體的最大量不超過 1×109），仔細去除所有培養基上清，以后的所有離心步驟均在室溫（20-25℃）進行。

注意：如果培養基上清去除不完全，將對第二步中的細胞壁消化過程產生抑制。

2.用含有溶菌酶的 100μl TE 緩沖液（客戶自己配制，配制方法見下表）徹底重懸菌體，孵育時間見下表。

3.加入 350μl 裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），渦旋振蕩混勻。

4.將裂解混合液轉移至過濾柱 CS1 上(過濾柱 CS1 放入收集管)，12,000 rpm(~13,400×g)離心 2min，收集濾液。

5.向濾液中加入 250μl 無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。

6.將“裂解液/乙醇混合液”（含沉淀）移取至吸附柱 CR1 中（吸附柱 CR1 放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )離心 30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

注意：將溶液和沉淀轉移至吸附柱 CR1 時，如果體積大于吸附柱容量，可以分次完成。

7.向吸附柱 CR1 中加入 500ul 溶液 RW，12,000 rpm (~13,400×g )離心離心 1 min，丟棄濾液，將吸附柱CR1 放回收集管中。

8.DNase Ⅰ降解。

注意：如同時操作多組樣本，請使用前現配新鮮的 DNaseⅠ工作液,請勿預先配制保存 DNaseⅠ工作液。

9.向吸附柱 CR1 中加入 500μl 溶液 RW，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

10.向吸附柱 CR1 中加入 600μl 漂洗液 PW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CR1 放回收集管中。

11.重復操作步驟 10。

12.12,000 rpm(~13,400×g)離心 3 min，將吸附柱 CR1 置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇。

13.將吸附柱 CR1 轉入一個新的 RNase-Free 離心管中，加入 30-100 μl 無酶雙蒸水至吸附柱的膜中心，室溫靜置 2 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心 1 min，得到 RNA 溶液。

注意：洗脫緩沖液體積不應少于 30 μl，體積過小影響回收效率；RNA 溶液請于-70℃保存。

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1.《Multifunction Sr, Co and F co-doped microporous coating on titanium of antibacterial, angiogenic and osteogenic activities》
作者：Jianhong Zhou ,Lingzhou Zhao 影響因子：4.259
期刊：《Scientific Reports 6, Article number: 29069 (2016)》 PMID：27353337

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培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒

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