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Western印跡法，也被稱為Westernbloter、Westernblotting，是檢測蛋白質的重要方法之一。

其操作流程如下：

1.細胞裂解：將待檢樣品進行機械或化學裂解，以釋放蛋白質。
2.SDS-PAGE電泳：將蛋白質樣品加入SDS-PAGE凝膠，根據分子量大小進行電泳分離。
3.轉印：將分離的蛋白質遷移到聚丙烯酰胺凝膠薄膜（PVDF）或硝酸纖維素薄膜上。
4.封閉：使用阻斷劑（例如非脂乳精或牛血清白蛋白）封閉薄膜上未被蛋白質占據的位置，防止非特異性結合。
5.抗體孵育：將特異性抗體與薄膜上的目標蛋白質結合，形成免疫復合物。
6.洗滌：洗去未結合的抗體和其他雜質。
7.二次抗體孵育：加入與第一抗體親和的酶標記二抗，形成免疫復合物。
8.洗滌：洗去未結合的二次抗體和其他雜質。
9.顯色：使用酶底物或熒光標記物，使免疫復合物產生可見的信號。
10.影像分析：使用成像系統記錄并分析蛋白質帶的強度和大小。
以上是WesternBlotting的操作流程，廣泛應用于蛋白質檢測和研究中。

下面簡要介紹了WesternBlotting實驗的步驟。
1、材料組織：對組織塊進行稱重
2、通過使用液氮，可以破碎組織樣本。
3、將RIPA緩沖液添加到每克組織中，每克組織的RIPA緩沖液用量為3ml。然后，將PMSF加入到每克組織中，PMSF濃度為10mg/ml，每克組織需要添加30μl的PMSF。
請將樣品保持在4℃，然后使用Polytron進行進一步的勻漿（15,000轉/分，持續1分鐘）。
4、在每克組織中加入PMSF（每克30毫升）示，PMSF濃度為10毫克/毫升）。然后將樣品放在冰上孵化30分鐘。
5、將樣品放入離心管中，將離心管放入離心機中，在4℃下進行離心操作，設置離心力約為20,000g（約15,000轉速），離心時間為15分鐘。
6、細胞裂解液即為上清液，可以被儲存在-20℃的容器中。
7、使用布拉德福比色法來測定蛋白質的濃度。
8、取相同質量的細胞裂解液，其體積和蛋白濃度保持不變，然后加入等量的2×電泳樣品緩沖液。
9、將水煮沸后，將東西浸泡在熱水中三分鐘。
上樣
11、電泳過程中使用20mA的濃縮膠和35mA的分離膠。
12、電轉膜儀通過電流轉移膜(100mA40分鐘)。
13、薄膜采用麗春紅進行染色，而膠則使用考馬斯亮藍進行染色。
14、進行Westernblot實驗時，可以使用試劑盒進行著色。
15、分析比對記錄

進行WesternBlotting的具體實驗步驟如下：
以下操作程序供西方參考：
1、進行蛋白質樣品收集(Proteinsamplecollection)
可以使用適當的溶解液對貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣本進行裂解。對于一些特定的亞細胞組分蛋白，例如細胞核蛋白、細胞質蛋白、線粒體蛋白等，可以通過參考相關文獻的方法提取，也可以使用試劑盒來提取。
在收集蛋白質樣品后，需要檢測每個樣品的蛋白質濃度，以確保它們的上樣量一致。根據使用的裂解液不同，我們需要選擇合適的方法來測量蛋白質濃度。不同的蛋白質濃度測量方法在去垢劑和氧化劑方面存在兼容性差異。如果我們使用的是北京博奧森生物技術有限公司生產的WIP細胞裂解液，我們可以選擇使用BCA蛋白濃度測量試劑盒。
2、電泳，又稱為電泳分離技術，是一種基于電場效應的物質分離方法。它利用帶電物質在電場中的遷移速度不同，通過電場驅動，將混合物中的物質分離開來。電泳廣泛應用于生物化學、生物醫學、生命科學等領域，以實現樣品分離、純化、定性和定量分析等。
（1）、準備SDS-PAGE膠液
可以參考一些文獻，來制備SDS-PAGE電泳凝膠，并且也能使用由博奧森制造的SDS-PAGE疑膠制備試劑盒進行制備。該試劑盒包括配方制備不同濃度SDS-PAGE所需的所有試劑（除了水和凝膠制備器具）。
樣品處理
將適量的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入到收集的蛋白樣品中。例如，可以使用2X或5X濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的緩沖液可以減少上樣的體積，從而在相同的上樣孔中能夠上樣更多的蛋白。可以按照相關文獻制備5X濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，也可以使用博奧森公司制造的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）。在100℃或熱水中加熱3-5分鐘，以確保蛋白質得到充分變性。
上樣與電泳
在冷卻至室溫后，可以將蛋白質樣品直接置于SDS-PAGE膠的樣品孔中。為了更方便地觀察電泳性能和轉膜效果，并判斷蛋白質的分子量，最好使用預先染色的蛋白質含量標準。
進行電泳實驗時，通常建議在樣品加載到上膠之前使用低壓恒壓電泳。而當溴酚藍進入下膠后，建議使用高壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似裝置，低壓可以設置在80-100V之間，而高壓則可以設置在約120V左右。如果進行SDS-PAGE實驗，可以使用普通的電泳儀來滿足要求。另外，為了方便電泳操作，可以采用SDS-PAGE全程恒壓的方法。一般來說，可以將電壓設置為100V，然后將時間設置為90至120分鐘。通過設置合適的時間，可以避免頻繁進行電泳操作。
在一般的電泳過程中，可以通過以下兩種方式來結束電泳：一是等到溴酚藍染料達到膠的底部周圍停止電泳，二是根據預先設定的蛋白質含量標準來結束電泳。根據預期的分離效果，當目的蛋白質經過適度的分離后，可以選擇結束電泳過程。
3、膜轉移技術
針對Western實驗，我們建議選擇PVDF膜。不過，你也可以選擇硝酸纖維素膜（NC膜）或PVDF膜（二氟化樹脂膜孔徑為0.45um）。需要注意的是，硝酸纖維素膜相對脆弱，在操作過程中容易破裂，特別是用鑷子夾住的時候。所以在使用時請參考制造商推薦的使用步驟。
一般來說，使用Bio-Rad標準的濕式膜轉換設備時，推薦的膜轉換電壓設置為120V，膜轉換時間為30-60分鐘。具體的膜轉換時間應根據目的蛋白質的分子量而定。如果目的蛋白質的分子量較大，那么所需的膜轉換時間就會更長一些；而如果目的蛋白質的含量較低，那么所需的膜轉換時間就會相應減少。
在進行轉膜過程中，尤其是高電流快速轉膜時，通常會出現嚴重的發熱現象。為了最佳效果，建議將轉膜槽放置于冰浴中進行轉膜。可以通過觀察使用的預染蛋白質含量標準來評估轉膜效果，通常來說，最大的1-2個雜帶較難完全轉移到膜上。另外，通過使用麗春紅染色液來染色膜，也可以觀察轉膜的實際效果。而使用考馬斯亮藍快速染色液來染色完成轉膜的SDS-PAGE膠，可以觀察蛋白質的殘留情況。
4、封閉(Blocking)
轉膜完成后，應立即將蛋白膜放入預先準備好的Western洗滌液中，沖洗1-2分鐘，以去除膜上的轉膜液。在轉膜完成后的整個過程中，務必注意保持膜的濕潤，避免膜干燥，否則可能導致較高的背景信號產生。
使用微型臺式真空泵抽取洗滌液，然后加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，在室溫下封閉60分鐘。對于一些高背景的抗體，可以在4℃條件下封閉一夜。
5、主要抗體孵育
根據Western一抗說明書的指導，以適當的比例稀釋Western一抗稀釋液。
使用微型臺式真空泵吸取封閉液后，立即添加稀釋好的抗體，并在室溫或4℃的側擺搖床上緩慢搖晃孵化一小時。若一小時的孵化效果不佳，可以在4℃下繼續緩慢搖晃孵化一晚上。之后回收抗體，加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖晃清洗5-10分鐘。吸取洗滌液后，再次加入洗滌液進行清洗5-10分鐘，總共進行3次清洗。若結果的背景較高，可以適當延長清洗時間并增加清洗頻率。
6、二次抗體孵育
根據二抗說明書的指導，使用Western二抗稀釋液適當稀釋辣根過氧化物酶(HRP)二抗標記。
使用微型臺式真空泵吸取洗滌液后，立即加入稀釋的二抗，并在側擺搖床上緩慢搖晃孵化一小時，溫度保持在室溫或4℃。取出二抗后，加入Western洗滌液，再次在搖床上緩慢搖晃清洗5-10分鐘。將洗滌液吸取后再次加入洗滌液，繼續清洗5-10分鐘。總共需要進行3次清洗。如果結果背景較高，可以適當延長清洗時間，增加清洗的頻率。
7、蛋白質的檢測
使用BeyoECL和Western瑩光檢測試劑等ECL類試劑，根據相關說明書對蛋白質進行檢測。
在片子處理的過程中，可以使用X光自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以使用顯影定影試劑盒，手工配置顯影液和定影液來進行洗片處理。
8、薄膜再利用
如果蛋白質樣品非常寶貴，可以使用Western一次抗體和二次抗體清除液來處理蛋白質膜，以便可以重復使用。

在實驗時，需要注意以下三點事項：
1.安全第一：在進行實驗時，必須要注意安全。要穿戴實驗室所要求的防護裝備，如實驗服、手套、護目鏡等，并遵守實驗室的安全操作規程。
2.仔細觀察：在實驗過程中，要仔細觀察實驗現象和結果，注意記錄和收集有關的數據和信息。只有充分觀察和記錄，才能得出準確可靠的實驗結論。
3.保持實驗環境整潔：實驗室應保持干凈整潔。實驗結束后，要清理實驗臺、清洗實驗器材，并將廢棄物正確妥善處理。保持實驗環境整潔有助于提高實驗的效率和準確性。

實驗中出現的問題及處理辦法

【2023/10/26 17:33:58】